Flúrljómunarsía er nauðsynlegur hluti í flúrljómunarsmásjá. Dæmigert kerfi hefur þrjár grunnsíur: örvunarsíu, útblásturssíu og tvíspeglun. Þeim er venjulega pakkað í tening þannig að hópurinn er settur saman í smásjána.
Hvernig virkar flúrljómunarsía?
Örvunarsía
Örvunarsíur senda ljós af ákveðinni bylgjulengd og hindra aðrar bylgjulengdir. Hægt er að nota þá til að framleiða mismunandi liti með því að stilla síuna þannig að aðeins einn litur hleypi í gegn. Örvunarsíurnar koma í tveimur aðalgerðum - langhliðasíur og bandrásarsíur. Örvarinn er venjulega bandpass sía sem fer aðeins framhjá bylgjulengdunum sem flúorfórinn gleypir og lágmarkar þannig örvun annarra flúrljómunargjafa og hindrar örvunarljós í flúrljómunarútstreymisbandinu. Eins og sést með bláu línunni á myndinni er BP 460-495, sem þýðir að það getur aðeins farið í gegnum flúrljómun 460-495nm.
Það er komið fyrir innan lýsingarbrautar flúrljómunarsmásjár og síar út allar bylgjulengdir ljósgjafans nema flúorfórörvunarsviðið. Lágmarksflutningur síunnar ræður birtustigi og ljóma mynda. Mælt er með að lágmarki 40% flutningur fyrir hvaða örvunarsíu sem er þannig að sendingin sé helst >85%. Bandbreidd örvunarsíunnar ætti að vera algjörlega innan örvunarsviðs flúorfórs þannig að miðbylgjulengd (CWL) síunnar sé sem næst hámarksörvunarbylgjulengd flúorfórsins. Optical density (OD) örvunarsíunnar ræður myrkrinu á bakgrunnsmyndinni; OD er mælikvarði á hversu vel sía hindrar bylgjulengdirnar utan sendingarsviðs eða bandbreiddar. Mælt er með að lágmarki OD 3,0 en OD 6,0 eða meira er tilvalið.
Losunarsía
Losunarsíur þjóna þeim tilgangi að leyfa æskilegri flúrljómun úr sýninu að ná til skynjarans. Þeir loka fyrir styttri bylgjulengdir og hafa mikla útbreiðslu fyrir lengri bylgjulengdir. Síugerðin er einnig tengd númeri, td BA510IF á myndinni (trufluhindrunarsía), sú merking vísar til bylgjulengdarinnar við 50% af hámarksflutningi hennar.
Sömu ráðleggingar um örvunarsíur gilda fyrir útblásturssíur: lágmarksflutningur, bandbreidd, OD og CWL. Losunarsía með fullkominni CWL, lágmarks sendingu og OD samsetningu veitir bjartustu mögulegu myndirnar, með dýpstu mögulegu lokuninni og tryggir greiningu á daufustu losunarmerkjum.
Díkróískur spegill
Tvíkroíski spegillinn er settur á milli örvunarsíunnar og útblásturssíunnar í 45° horni og endurkastar örvunarmerkinu í átt að flúorófórnum á meðan hann sendir útblástursmerkið í átt að skynjaranum. Tilvalin tvíþættar síur og geislaskiptingar hafa skörp umskipti á milli hámarks endurkasts og hámarksflutnings, með >95% endurkast fyrir bandbreidd örvunarsíunnar og útsending >90% fyrir bandbreidd útblásturssíunnar. Veldu síuna með skurðarbylgjulengd (λ) flúorfórsins í huga, til að lágmarka flökkuljós og hámarka merki-til-suðhlutfall flúrljómandi myndar.
Tvíkróíski spegillinn á þessari mynd er DM505, svo nefndur vegna þess að 505 nanómetrar er bylgjulengdin við 50% af hámarksflutningi þessa spegils. Sendingarferillinn fyrir þennan spegil sýnir mikla útsendingu yfir 505 nm, bratt lækkun í útsendingu til vinstri við 505 nanómetra og hámarks endurspeglun vinstra megin við 505 nanómetra en gæti samt haft einhverja útsendingu undir 505 nm.
Hver er munurinn á langrásarsíu og bandrásarsíu?
Flúrljómunarsíur má skipta í tvær gerðir: langrás (LP) og bandpass (BP).
Langrásarsíur senda langar bylgjulengdir og hindra þær styttri. Skurðbylgjulengdin er gildið við 50% af hámarksflutningi og allar bylgjulengdir fyrir ofan skurðinn eru sendar með langrásarsíunum. Þeir eru oft notaðir í tvílitna spegla og útblásturssíur. Nota skal langhliðasíur þegar notkunin krefst hámarks losunarsöfnunar og þegar litrófsaðgreining er ekki æskileg eða nauðsynleg, sem er almennt raunin fyrir rannsaka sem mynda eina tegund sem gefur frá sér í sýnum með tiltölulega lítið magn sjálfflúrljómunar í bakgrunni.
Hljómsveitarsíur senda aðeins ákveðið bylgjulengdarsvið og loka fyrir önnur. Þeir draga úr víxlmælingu með því að leyfa aðeins sterkasta hluta flúorófórgeislunarrófsins að sendast, draga úr sjálfflúrljómun hávaða og bæta þannig hlutfall merkis og hávaða í háum sjálfflúrljómunarsýnum í bakgrunni, sem langhliðasíur geta ekki boðið upp á.
Hversu margar tegundir af flúrljómunarsíusettum getur BestScope útvegað?
Sumar algengar tegundir sía eru bláar, grænar og útfjólubláar síur. Eins og sést í töflunni.
| Síusett | Örvunarsía | Díkróískur spegill | Hindrunarsía | LED lampi Bylgjulengd | Umsókn |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Flúrljómandi mótefnaaðferð ·Asidín appelsína: DNA, RNA ·Auramín: Berklabakteríur ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Flúrljómandi mótefnaaðferð ·Própídíumjoðíð: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · Sjálfvirk flúrljómun athugun ·DAPI: DNA litun ·Hoechest 332528, 33342: notað fyrir litningalitun |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katekólamín ·5-hýdroxýtryptamín ·Tetracýklín: Beinagrind, tennur |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Síusett sem notuð eru við flúrljómun eru hönnuð í kringum helstu bylgjulengdirnar sem notaðar eru í flúrljómun, sem byggir á mest notuðu flúorfórunum. Af þessum sökum eru þeir einnig nefndir eftir flúorófórnum sem þeir eru ætlaðir til myndatöku, eins og DAPI (blár), FITC (grænn) eða TRITC (rauður) síukubbar.
| Síusett | Örvunarsía | Díkróískur spegill | Hindrunarsía | LED lampi Bylgjulengd |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Rauður | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Hvernig velur þú flúrljómunarsíu?
1. Meginreglan við að velja flúrljómunarsíu er að láta flúrljómun/geislunarljósið fara í gegnum myndaenda eins langt og hægt er og loka algjörlega örvunarljósinu á sama tíma, til að fá hæsta merki-til-suð hlutfall. Sérstaklega fyrir beitingu fjölljóseinda örvunar og heildar innri endurspeglunar smásjá mun veikur hávaði einnig valda miklum truflunum á myndáhrifum, þannig að krafan um merki til hávaðahlutfalls er hærri.
2. Þekkja örvun og losunarróf flúorófórsins. Til að smíða flúrljómunarsíusett sem myndar hágæða mynd með mikilli birtuskilum með svörtum bakgrunni, ættu örvunar- og útblásturssíur að ná mikilli útsendingu með lágmarks passbandsgára yfir þau svæði sem samsvara flúorofórörvunartoppum eða losun.
3. Íhugaðu endingu flúrljómunarsía. Þessar síur verða að vera ónæmar fyrir sterkum ljósgjöfum sem mynda útfjólubláu (UV) ljós sem gæti leitt til „brennslu“, sérstaklega á örvunarsíuna þar sem hún er háð fullum styrkleika lýsingargjafans.
Mismunandi flúrljómandi sýnishornsmyndir
Aðföngunum er safnað og skipulagt á netinu og er eingöngu notað til náms og samskipta. Ef það er einhver brot, vinsamlegast hafðu samband við okkur til að eyða.
Pósttími: Des-09-2022